Podobně jako fluorescenční, i konfokální mikroskopie využívá fluorescence, tj. schopnosti atomů a molekul absorbovat určité množství excitační energie a vzápětí ji vydat zpět v podobě emisního záření o vyšší vlnové délce a nižší energii. Barva signálu je dána emisní vlnovou délkou. Fluorochromy jsou fluorescenční barviva, která se používají pro barvení preparátů. Vazbou fluorochromu na určitou strukturu či molekulu lze v buňce lokalizovat organely nebo produkty metabolismu. Např. často využívaný pro detekci životaschopnosti je fluorescein diacetát (FDA), který proniká přes cytoplazmatickou membránu, kde je metabolismem živé buňky transformován na fluorescein se zeleným signálem.
Fúzní proteiny – jako první byl izolován zelený fluorescenční protein (GFP) z mořské medúzy Aequoria victoria, u které byl objeven jako součást bioluminiscence. Vlastnosti GFP: délka 230 aminokyselin, MW= 27-30 kDa, λexc = 390-470 nm / λemise = 509 nm; v současnosti je dostupná řada dalších mutací GFP a variant s odlišnými spektrálními vlastnostmi (např. BFP, CFP, YFP, RFP). Výhody: pozorování dynamiky proteinových struktur v živé buňce bez nutnosti fixace nebo možnost užití inducibilních promotorů – tj. indukce tvorby GFP-proteinů jen v určitém čase. Nevýhody: fůze s GFP se může projevit v nefunkčnosti fúzního proteinu, fototoxicita modrého krátkovlnného světla používaného pro excitaci BFP.