Konfokální mikroskopii charakterizuje rozlišení a kontrast vyšší než u ostatních metod světelné mikroskopie. Výhodou je především potlačení signálu z rovin nad a pod rovinou zaostření a možnost snímání sérií optických řezů, jejichž skládáním lze rekonstruovat pozorovaný objekt v 2,5D projekci. To souvisí s vysokými nároky na komplexní provoz, tj. technické vybavení a rychlost PC. Předností a zároveň omezením metody je využití laseru jako zdroje světla, protože intenzivní osvětlení vzorku přispívá k rychlejšímu vysvícení použitých fluorochromů nejen v místě snímání, ale i v místech kudy paprsek prochází k místu zaostření. Při LSCM objekt mimo rovinu ostrosti nezpůsobí rozostření, ale není zobrazen; prostorový obraz vzniká sw zpracováním = velká hloubka ostrosti; blednutí (bleeching) objektu je omezeno díky zkrácení doby expozice excitačním zářením; kvantitativní měření jsou přesnější, protože nejsou zkreslena hloubkou.
Laserový řádkovací (= rastrovací) KM využívá jako zdroj světla laserový paprsek, který je přes systém clonek zaměřován přímo na pozorovaný preparát, resp. bod preparátu. Preparát je tedy skenován bod po bodu tak, že je buď zdroj světla statický a preparát se pohybuje („stage scanning“) nebo se naopak pohybuje zdroj světla a statický je preparát („beam scanning“). LSCM je vhodný především pro zobrazování fixovaných preparátů.
Jiným principem skenování preparátu je rotující disk (= spinning disc) známý také jako Nipkowovův kotouč, což je rychle rotující perforovaná destička, na které je mnoho vzájemně oddělených clonek a přes kterou je světlo zaměřováno na studovaný objekt. Umožňuje zobrazovat několik bodů preparátu najednou - snímání je tedy rychlé a na pozorovaný objekt působí světlo s nižší intenzitou. Proto je tato metoda vhodná pro pozorování rychlých dějů v živých buňkách.
Úzký svazek laseru (intenzivní bodový zdroj světla) směřuje skrz první konfokální clonku na dichromatické zrcadlo, které jej objektivem zaměřuje na určitý bod preparátu, jehož průměr odpovídá difrakční (= rozlišovací) mezi. Preparát je umístěn v ohniskové rovině, kterou vybírá počítač, resp. skenovací zařízení. Odražené (= emitované) světlo prochází opět objektivem, dichroickým zrcadlem, bariérovým filtrem, druhou konfokální clonkou a nakonec dopadá před fotonásobič. Druhá clonka filtruje světlo pocházející z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Výsledné informace o preparátu jsou nakonec předány do skenovacího zařízení, kde jsou uloženy také informace o souřadnicích X-Y daného bodu, díky nimž je potom počítač schopen sestavit obraz celého preparátu.
Základním principem LSCM je to, že netvoří obraz najednou, ale řádkováním bod po bodu. Tak jsou snímány jednotlivé optické body v rovině XY a navíc díky přesně definovanému posunu v ose Z i jednotlivé optické řezy. Obraz celé zaostřené roviny XY lze získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů: 1/ rozmítání laserového paprsku; 2/příčný posuv vzorku před objektivem; 3/ posuv objektivu.