Multifotonová mikroskopie je založena na principu snímání světlem, jehož energie je příliš nízká pro excitaci fluorochromu. V místě fokusu dochází k setkání dvou nebo tří nízkoenergetických paprsků (fotonů) a výsledná sečtená energie se stává dostatečnou pro excitaci daného fluorochromu, a to pouze v místě zaostření. Pro osvětlení vzorku se využívá světlo s vlnovou délkou, která je násobkem absorpčního maxima použitého fluorochromu. Např. při dvoufotonové excitaci fluoresceinu (absorpční maximum při 500 nm) osvětlení laserem o vlnové délce 1000 nm vede k absorpci 2 fotonů v místě zaostření. Výhodou metody je menší rozptyl světla při vyšších vlnových délkách, nevysvěcování fluorochromu z neozářených částí vzorku, vysoká rozlišovací schopnost a vysoká citlivost. V současnosti se běžně používá dvou- či třífotonová excitace, s výhodou pro tlusté vzorky (více než 100 µm).
„Multiple-beam“ - konfokální systémy s paralelním skenováním více laserovými paprsky (nejčastěji uspořádány v linii), které zrychlují skenování limitované dobou saturace fluorochromu. Většina těchto systémů opticky rekonstruuje obraz za použití vysoce citlivých CCD detektorů. Vhodné pro velmi rychlé buněčné děje, např. studium vápníkových kanálů.
Metoda vyvinutá původně pro zobrazování laterální difůze molekul v membránách. Fluorescenční molekula je fúzována se zkoumaným proteinem nebo membránovými lipidy. Po ozáření vybraného místa silným excitačním světlem je fluorescence molekul cíleně vysvícena. Pozorujeme dynamiku obnovení fluorescence ve vysvíceném místě, které svědčí o laterálním pohybu molekul v membránách, kontinuitě membránových organel (ER nebo GA), pohybu zkoumaných molekul nebo transportu molekul (cytoskelet, vápníkové ionty).
FRET je mnohostranná metoda vhodná pro zobrazení interakcí molekul při suboptických rozlišeních, využívaná i ke kvantitativním analýzám (měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami in vivo a in vitro). První fluorochrom (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou, energie je přenesena na druhý fluorochrom (akceptor), který vyzáří přijatou energii ve formě fluorescence. Základní podmínky pro FRET: 1/ Donorový a akceptorový fluorochrom, absorpční spektrum akceptoru se musí překrývat s emisním spektrem donoru. 2/ Aby došlo k přenosu energie, musí být donorový a akceptorový fluorochrom velmi blízko (většinou 10-100 A). Jednou z technik stanovení účinnosti FRET je měření vzrůstu fluorescence donoru po kompletním vysvícení akceptoru. Experimenty jsou založeny na změnách poměru fluorescence emitované oběma fluorochromy, které se stanovují ve vybraných oblastech vzorku.
Rozšíření FRET podpořila dostupnost vhodných fluorochromů, dokonalejší mikroskopické systémy, metody pro korekci spektrálního prosvěcování a možnosti kombinací s dalšími technikami. FRET a FLIM jsou aplikovány při studiu interakcí protein-protein, protein-DNA, studiu konformačních změn proteinů, polynukleotidů, DNA, analýze vazebných sekvencí nebo vysokovýkonném rastrování.
Slouží ke sledování interakcí molekul v živých organismech podobně jako u FRET, ale aspoň jeden z fluorochromů se v daném organismu vyskytuje přirozeně.
Každý fluorochrom je kromě emisního spektra charakterizován i životností fluorescence (τ), která je definována jako průměrný čas, po který molekula zůstává v excitovaném stavu před návratem do základního stavu. V praxi znamená čas, po který se intenzita fluorescence rozkládá na 1/e původní intenzity (I0) okamžitě po excitaci (tj. 37% I0). Tohoto principu využívá FLIM, metoda nezávislá na koncentraci fluorochromu, intenzitě excitace a dalších faktorech limitujících měření založená na intenzitě ustáleného stavu. Metody pro měření životnosti fluorescence lze rozdělit do dvou kategorií: frekvenční a časové (= pulzní) metody. Kombinace analýzy životnosti se zobrazováním při FLIM lze využít ke studiu prostorově rozlišených signálů (např. topologie vzorku), či získání dodatkových informací (rozpoznání molekul, heterogenita nanoprostředí, vazby molekul).
Kombinovaná příprava vzorků umožňuje pozorování téhož preparátu fluorescenční, konfokální, elektronovou mikroskopií a návazné softwarové zpracování obrazu.